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＜Set５：細胞培養実験（Exp.A, B）の実施要領 ：目次へ＞
（実験キットのリクエスト方法も）
＜2018CG細胞実験法:図説解説集、 受講者へ：原理解説 、 2018生物学＞
| ＊ 本編「考える生物学：細胞実験に基づく生物学」は下記「Set 1～６」に基づき実施される。 ＊ Set-TopとSet 1では、演習講義の概要を扱う。Set2ーSet5は細胞実験の実施要領である。 ＊ 下パネル「話題集1～６」は、細胞実験学習に基づく動物体の成り立ちに関わる話題（命題）。 |
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| Set-Top | Set１へ | Set２へ | Set３へ | Set４へ | Set５:ココ | Set６へ |
| 本編の 目次へ （下記） |
本演習の 主な実施 課題と話題 |
シオリ式 細胞標本観察 ：構造と観察 |
細胞培養実験 (材料と方法) |
細胞実験 の意味意義 ：12問 |
細胞実験 ：実施要領 ：請求方法 |
配布資料 テキスト ワークシート |
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このシート 目次へ |
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| 講義配布テキストと その講義スライド、簡易細胞実験マニュアル、ワークシートPDF、 関連資料：生物学習内容構成論、細胞実験学習の受講者へ：解説と原理、 体の中身の描き方、 動物生理、 細胞生理、 BioMTX 、バーチャル顕微鏡観察へ、 組織学自主トレへ |
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本シート〔Set 5〕の目次：細胞培養実験（Exp.A, B）の実施要領
（実験キットのリクエスト方法も）
1. 実験工程の概要（はじめに・実験A&Bの比較・実験実施のポイント）、
2a. 実験材料一覧：解説とポイント 2.b. 実験材料の写真と工程別の必要物品リスト、
3. 実験キット構成品の数量算出法（3.1 Exp A、3.2 Exp B)：リクエスト前の確認
＜4.の目次：はじめに 細胞実験キットを試してみたい方へ：概要説明＞
4.1. 細胞管理と有効期限について、
4.2. リクエスト前の状況確認、 4.3 実施計画の立案と協議、 4.4 実施終了後の情報提供
5. 実験キット提供の付帯条件（略記）、 【上記の3. 4をまとめてPDF印刷用を開く】
＊＊ 印刷資料：実験マニュアル[ 実験AのPDF印刷用 ]、 [実験A/B一緒のPDF印刷用 ] ＊＊
（実験学習/教材実験を行う場合はこのPDFの記載方法を最優先とします：時々修正しています）
＊＊ 移動：CG細胞実験学習の図説解説集へ ＊＊
（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.0 中 Fig.00 右 Fig.000)
＜先頭行へ移動＞
このシート（Set 5）では、前出の「セット３.実験マニュアル」あるいは「図説解説集：CG細胞実験」に基づき、実施担当者の便宜・観点を念頭に、 1.実験工程の俯瞰的な概要表記、 2.実験材料一覧：解説とポイント、 3.実験キット構成品と数量算出法（Exp A用、Exp B用）について解説を行います。その目的は、受講者多数の場合でも迅速かつ適切な計画や準備を可能とするためです。なお、実験キットを試してみたい方へのメッセージは「4.ココ」で参照です。
＜1. 実験工程の概要：はじめに＞
| 工程 | 実験A.単純培養実験 (２サークル/CG) |
実験B.お絵描き実験 （１サークル/CG） |
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1 |
カバーガラスの準備 |
SG上にCGの左右辺をテープ止めの後、PFPで液止め円を２つ描く（雛形を利用）。CG左上には油性ペンの目印を付す。 |
MC処理済みCG（MC/CG）を左記と同様に準備し、PFPによる液止め円はひとつ。加温溶解Gelを付けた綿棒で絵文字を描き乾燥30分。 |
2 |
細胞液の調製 |
1) 細胞バッグに水平振動を与え分散させ、2) バッグを開封し、3) ピペッティングの後、4) その細胞液を遠心チューブに加える。 5) 遠心分離の後、6) 上澄みを捨て、7) 紙タオルで余液を除き、8) タッピング。 9) 培養液を加え、10) 丁寧にピペッティングし、11)細胞を再浮遊させる。 |
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3 |
細胞 |
円内に2滴のB-Medを滴下し、2で調製した細胞液を1滴の後に静置培養。 培養温度は28-32℃ |
調製した細胞液を円内に６滴加え、適所に静置し、培養90分以上。 培養温度は25-28℃ |
4 |
固定・染色 |
細胞液を捨て、円内にFixは２滴2分。水洗後、CVは２滴3分処理、水洗。完成。 |
細胞液を捨て、Fixは２滴2分。水洗後、CVは3滴3分処理、水洗。完成。 |
略語. SG：スライドガラス、CG：カバーガラス、 PFP：パラフィン鉛筆、FB細胞：フィルムバッグ収容FHLS細胞、 CR細胞 ：遠心再浮遊した細胞、 MC：メチルセルロース液（血清アルブミンの代替液）、 MC/CG：MC処理済みのCG、 Gel：ゼラチン（コラーゲンの変性物）、 B-Med：培養液、 Fix：固定液、 CV：染色液 |
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＊実技方法は「図解集CG細胞実験」も参照してください（別シートへ移動：ココ）。
（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.1 中 Fig.2 右 Fig.3)
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.4 中 Fig.5 右 Fig.6 )
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.7 中 Fig.8 右 Fig.9 )
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.13 中 Fig.14 右 Fig.15 )
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.16 中 Fig.17 右 Fig.18 )
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.22 中 Fig.23 右 Fig.24 )
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.25 中 Fig.26 右 Fig.27)
Fig.25-27はスライドガラスの代わりに「樹脂ネット」にCGをワゴム止めした簡易方法。
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実験A・Bの操作上のポイント（注意事項です：工程操作の一部を表記）
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工程 |
実験A.単純培養実験(２サークル/CG) |
実験B. お絵描き実験（１サークル/CG） |
1 |
カバーガラスの準備 |
新品カバーガラス（CG）を使用。二つの液止め円のためCG左右の辺5mmくらいをテープ止めする。完成後は保存(可能)。 |
メチルセルロース処理カバーガラス（提供品）を用いる。綿棒は指定品。Gel塗抹の時はゆっくり強い筆圧。乾燥は重要30分。室温で保存可能。 |
液止めサークルを描くときは重ね書きで太線にする。テープ止めの時はCGがSGからはみ出さないように注意。テープの角は「折り合わせ」で用いる。 |
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2 |
細胞液の調製 |
実験Aは等量のB-Medで再浮遊（FB細胞1.5mlを遠心分離の後、1.5mlで再浮遊）。 |
実験Bは半量のB-Medで再浮遊（２倍濃度で用いるのでFB細胞2mlを遠心し1mlで再浮遊）。 |
工程3の直前に実施（事前練習が必要）。バランス確認後に遠心。遠心再浮遊は細胞表面の洗浄であり、実施しない場合、細胞の接着伸展には数時間を要す。従って上澄みは十分に除く。 |
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3 |
細胞 |
左円内にB-Med,CR細胞の順で滴下し、15分後（任意）、右円へ同じ操作。その5-10分後に固定。細胞活性は温度依存（低温では運度速度が低下）。28-30℃程度が最適。 |
培養時間は60分以上90分で完了。乾燥防止を行えば90分以上も可能。培養時間（待ち時間）は細胞にとっては自律的な活動時間。材料の意味意義などを協議・考察する。 25-28℃程度が適温です。 |
培養開始後は動かさない。培養時間の差異などの理由はWeb「実験解説と原理」を参照。 |
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4 |
固定・染色 |
A.Bで染色液の量が異なる。安全・安心操作に配慮する。混雑・混乱しない状況を確保する。 生徒さん実験では無害な固定液を用いる。 |
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＜細胞濃度について：重要＞ 実験Bでは「高濃度の細胞液を使用することで底面充填密度」を図り、敷石上に配列する細胞シートの形成を図る。 |
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＜補足：実験A/Bを同時に行う場合の細胞調製法 ＞
４人班（４人分）の実験A,Bを同時進行で行うためには、工程2（Step 2細胞液の準備）に工夫が必要である。下記はその細胞調製法の事例。 つまり、工程(1)が完成した状態で、
- ２本の遠心チューブのキャップに目印 A or Bを付記。 それぞれのチューブに2mlの細胞液を分注。
- ２本を同時に遠心分離（6500rpm 10秒）し、上澄みを捨てる。
- 物理的刺激「タッピング」を20回加えた後に、それぞれに1mlの培養液（B-Med）を加え、更に、ピペッティング10回（５回x２セット）。この操作により２倍濃度（濃縮）の細胞液1mlが2本得られる。
- チューブAの0.5mlをチューブBに移す。チューブAに培地（B-Med）を0.5ml加える。その結果、チューブAは等倍濃度で液量1.0ml、チューブBは２倍濃度で液量1.5mlになる。
以上により４人分の十分量の実験A.Bの細胞液を整う。
コメント： 工程（１）「カバーガラスの準備」は実験A,Bともに実施日とは別日に事前準備として行い、実施日（細胞バッグの開封日）の学習時間の確保に努めてください。
2a. 実験材料一覧・解説・ポイント（下線付きは実験B用）
下記の箇条書きは、本実験（A, B）に用いる材料の解説ですが、実験学習におけるそれらの意味意義については、構造（要素の配置とその繋がり）という視座視点に基づき、既に「ウェブ実演生物学/細胞培養実験の受講者へ：実験解説と原理」に記載したので、ここでは実験学習を計画実施する時に参考となる情報を記述します。下記の材料を用いた理由(経緯)、扱いのポイント、補足(その他)、の３区分を基本としています。
なお、本実験ではカバーガラスを用いた細胞培養法を紹介していますが、一般的な細胞培養技術から考えれば（の経験者なら）、安価な使い捨ての培養シャーレ（ディッシュ）でも良いのでは？といった疑問も生じるので、以下に簡略なコメントを付記します。もちろん、本実験を培養シャーレなど一般的な培養技術や無菌操作などで行うことは可能であり適切であることも事実です。
つまり、本実験（本システム）の特徴は、実践学習の場（実験学習）の現状・実情に対応させるため、迅速・簡便・確実・低コストの４項目を念頭として開発されています（省エネ・安全にも配慮しています・必要です）。
例えば、多数の受講者が対象の場合、１枚50円程度の培養シャーレでも研究者を別とすればその必要経費はそれほど安価ではない、また使用する培地などの量もそれなりに多いというのが実情です。つまり、カバーガラスなら約1/3の値段、培地の必要量は1/10程度ということから「CG培養法」を提案しています。更に、本編では解説していませんが、CG培養法をそのままパッキングを利用した薄層培養法に変えれば「細胞のライブ観察（擬似-微分干渉観察像）」も学習顕微鏡で可能であり、発展的な取り組みや課題研究などにも使える、ということも理由です。また、マイクロケミストリーのように、迅速・簡便・確実・低コストに加え、省エネ（廃棄物の削減）は今時の実践学習の場においても大切ということも念頭としています。
A.器具・機器． :材料の写真・イメージは「ココ」
□1） カバーガラス（CG： 24x40mm NEO MATUNAMU #C024401）、
□2) メチルセルロース(MC)処理済みのカバーガラス（MC/CG 自作調製）、
□3) 通常のスライドガラス（SG: 76x26mm）、
□4） パラフィン色鉛筆（PFP： TOMBO 紙巻き色鉛筆2285）、
□5） 卓上微量遠心分離機（6500rpm程度で10秒）
あるいは、通常の遠心分離機（1800rpm x 80秒が可能な機種）、
自作で：Fig11-13などを参照。
□6） 遠心チューブ（微量遠心の場合は2ml容量）、
□7） 栄研３号スポイト（滅菌済み）、
□8） 綿棒（タミヤクラフト綿棒：87106）、 あるいは食用の「竹串」
□9） 学習顕微鏡、
□10） 携帯カメラ
その他：□11）35mm培養シャーレ、
B.試薬・溶液. ：材料の写真・イメージは「ココ」
□1） フィルムバッグ細胞（FB細胞 無血清浮遊培養系の魚類細胞）FHLS、
□2） 液体培地/培養液（B-Med Waymouth’s MB 752/1 Ca-Free）、
□3） 固定液（G-Fix グルタルアルデヒド系）、あるいは（酢酸エタノール系：学習実験用）
□4) 染色液（CV クリスタルバイオレット）、
□5) ゼラチン液（Gel）
□6） 必要に応じてメチルセルロース液（MC）、
□7） お湯（Gel湯煎用）、
＊＊ その他（必要に応じて用いる）：
□8）精製水（DW）、
□9）リン酸緩衝食塩水/Caフリー（PBS-）、
□10）70%エタノール水（70%EtOH）、
□11）板ゼラチン、
C.備品など ：材料の写真・イメージは「ココ」
□1）CGスライドガラスの静置用小型トレー（又は10cmシャーレ）、
□2）スコッチメンディングテープ、
□3）ハサミ、
□4）細書き油性ペン、
□5）温度計、
□6) タイマー、
□7 紙コップ（小型・新品）、あるいは透明プラカップ、
□8）オモリ（大型ワッシャー）、
□9）紙ナプキン、
□10）50mlビーカー、
□11）小型ピンセット、
□12）遠心チューブ用スタンド、
□13）扇風機、
□14）ゴミ袋、
□15）水道・水バット、
□16）寒冷期は温度対策が必要。
D. 本実験で利用な便利グッズ（必需品）：材料の写真・イメージは「ココ」
：紙コップ（C7参照）、紙ナプキン（C9参照）、栄研３号スポイト（A7参照）
＜材料解説：A. 器具・機器＞
A. 器具・機器の解説．
□1） カバーガラス（CG： 24x40mm NEO MATUNAMI #C024401）
目的/理由. 指定のカバーガラス（硼珪酸ガラス）は都合よく動物細胞の接着反応に適した物性であるため（培養基質：CG表面はプラス電荷の状態を示し、細胞表面は糖蛋白などによるマイナス電荷のため、電気的中性の原則に基づき初期接着反応が無理なく進行）。同様な物性を示す一般的な細胞培養用ポリスチレン培養シャーレなどに比べそのコストは1/3程度。学習顕微鏡による標本観察にも適している。 ポイント. CGに触る時はその辺縁・外側で扱い培養に用いる内側は不用意に触れない。取り扱いに不慣れな場合はスコッチテープや両面テーブをカバーガラスの角に軽く押し当て「１枚釣り」を行う。透明なので黒紙などを背景として識別を容易にする。 補足. 通常のスライドガラス（ソーダ石灰ガラス：）は粗雑？な組成による製造品であり、安価ではあるが、そのままでは細胞毒性も生じ細胞の接着反応や細胞培養に適さない。所定製品（NEOガラス）は張り付き（複数枚が剥離しない）防止処理がなされているためストレスのない扱いが可能であり、その用途も広い（生物室常備品の扱いであろう）。 [リストA]へ戻る。
□2) メチルセルロース(MC)処理済みのカバーガラス（MC/CG）：実験B用
目的/理由. OEKAKI実験に用いるが、実験Aと同じ材質（培養基質）による細胞培養実験（実験B）を計画するため。0.025%MC溶液に一晩以上浸漬後に水洗・乾燥したカバーガラス（MC/CG：その結果、細胞は接着伸展ができなくなる）。 ポイント. メチルセルロースの意義は「Web実験解説と原理」を参照。但し、生体由来物質「血清アルブミン」の安価な代用品として使用したことには留意。補足. MC/CGは自作も可能。通常のポリスチレン製の培養シャーレの場合、MC処理は数秒で完了する（接着防止になる）が、カバーガラスではかなり長い処理時間を必要とする。なお、スライドガラス（ソーダガラス）は（も）非接着性の材質であり、実験Bの用途に使えるのではといった意見もあるが、油性ペンによる目印、パラフィン色鉛筆のサークル、また塗抹ゼラチンなどが培養中や固定染色中に剥離する場合があるので適当ではない。 [リストA]へ戻る。
□3) 通常のスライドガラス（SG: 76x26mm）
目的/理由.カバーガラスの支持基盤と染色標本の観察基盤である。ポイント. 支持基盤なので、工程操作に支障がない場合は樹脂ネットやプラスチック平板による代用も可能。 補足.洗浄により再利用が可能。 [リストA]へ戻る。
□4） パラフィン色鉛筆（PFP： TOMBO 紙巻き色鉛筆2285）
目的/理由. 撥水性の液止めサークル（を描く）によりCGに滴下した溶液の「液止めと山盛り」を可能とする。パラフィン・ロウソクなどでも代用は可能であるが、色付きペンはCGの識別を容易にする。 ポイント. 本製品で「描く」を繰り返すとパラフィン「クズ」が付着するのでその時は紙ナプキンで拭き取る。寒冷期は加温状態で使用するとなめらかに描ける。 補足.「描く」は物理的な圧力であり、支持基盤SG上で行わないとCGが割れるので注意。白色ワセリンによる液止めサークルも可能（は効果的）であるが、ベトベタな本品はCG標本の管理に難点を示す。 [リストA]へ戻る。
□5） 卓上微量遠心分離機（6500rpm程度で10秒）
あるいは、通常遠心分離機（1800rpm x 80秒）
目的/理由.フィルムバッグ細胞は静置浮遊状態のためReady-To-Useを可能とするが、細胞運動（形態変化）が活発・迅速に発現するためには、一般的な動物培養細胞と同様に、細胞表面に付着したゴミのような微細は夾雑物を取り除く（細胞洗浄）が必要である。工程2「細胞液の調製：遠心再浮遊」はその役割を担う。この操作を省略してCG培養を行っても数十分程度では細胞運動は生じない（期待できない）。従って、「上澄み」が残留したまま再浮遊すると同様な結果になってしまう。本件に関わる工程操作には注意・配慮が必要である。
動物細胞の遠心分離は通常そのダメージを考慮し1000rpm(数分)程度で処理するが、迅速簡便のため便宜的に6500rpm程度の微量遠心機を利用する。これらは速度固定であるので、検討結果から10秒程度なら細胞にダメージを与えることなく迅速簡便に細胞の再浮遊が可能という経緯から。 ポイント.この遠心条件(6500rpm 10秒)は一般的に言えば非常識であり、例えば、数十秒以上6500rpmで遠心すれば細胞にダメージが生じるので注意。 補足. 遠心機を備品として具備する高校実験室はそれほど多くない。その場合は貸し出しで対応しているが、下図のような安価な自作も可能である（これについては個別の質問として対応する）。 [リストA]へ戻る。
（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.10 中 Fig.11 右 Fig.12)
手作り遠心機
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□6） 遠心チューブ（微量遠心の場合は2ml容量）
目的/理由. 上記５）の微量遠心機に対応した規格チューブ（２ml容量）を使用する。 ポイント.遠心回転の時は対角線上をバランス重量とする（ほぼ液量が等しければ支障はない）。 補足.1.5ml規格チューブでも可能であるが、2mlチューブはストレスのない細胞液の扱いを可能にする。チューブキャップの開閉（ハンドリング）は両手指により確実なハンドリングで行う。 [リストA]へ戻る。
□7） 栄研３号スポイト（滅菌済み：CC2000）
目的/理由. 実験に適した規格/容量と指感覚にフィットした優良製品であるため。また、スポイトメモリ（刻印）の2.0レベルをハサミで切断すれば「切り取りによる小試験管：代用試験管」などに早変わりし、溶液分注や配布用などに使用できるの優れもの。 吸引量は液量刻印（メモリ）で最大3.0ml、滅菌済み透明ポリプロピレン製スポイト。 滴下量１滴は0.05mlとみなす。 ポイント. 実験工程のスポイト操作の前には刻印メモリ（液量）や感触の確認（練習）が必要（微量操作であるため「支点・力点・作用点」を意識した安定操作に努める）。ポンピングは３本指。 補足. 本品は１本18円程度であるが再生も容易。「水洗いとDWすすぎ」がスポイト操作（ポンピング）で簡単に行えるので再生利用（省エネ）は推奨事項。その他の物品についても同様（遠心チューブなども再生再利用）。
なお、４人１グループ（班）の教材実験の場合、スポイトの必要数は時に数百本以上のこともあり、低コスト化のためには工夫が必要である。10班以上の場合はぜひ事前協議を行いましょう。 [リストA]へ戻る。
□8） 綿棒（タミヤクラフト綿棒：87106）・あるいは「竹串」：実験B用
目的/理由. 実験B（お絵描き実験）の工程1「ゼラチン液をカバーガラスに塗る（塗抹）」に使用するが、液が浸潤しても先端が膨潤しないクラフト綿棒（指定品）が最適である。 ポイント. 本品綿棒の先端に少量のゼラチンを付ければ十分量が浸透するので、先端に紙ナプキンを付け、余液は除き使用する（十分すぎるくらい除いても大丈夫：細胞には見えるよ！）。ゼラチン塗抹は重要な工程であり厚塗りは厳禁。その理由は厚塗り乾燥させた塗抹ゼラチンで細胞培養を行うと、乾燥ゼラチンが吸水・膨化し、細胞が接着伸展した後にカバーガラスから剥離するため。芯棒を栄研３号スポイトの先端に差し込むと安定して使用が可能。 補足. フェルト製？替え芯（COPIC：デザインペン）も有効であるが、低コストには本品（タミヤ綿棒）が適当である。
＜補足：綿棒の代替「食用竹串」の使用法＞
１）竹串先端の数ミリを「爪切り」でカットする。 ２）切り口が丸くなるようにスライドガラスの上でその角を「押し付け・動かし」丸くする（必須）。 ３）溶解ゼラチン液に竹串を数分以上漬け置きにする。 ４）描く(塗抹)の前には、竹串を指で保持し、手首の軽くスナップで「先端の余分な液を飛散」させる。 ５）任意の絵文字を描く。但し、ゆっくり、強い筆圧で描く。直後は塗り液が残るので形が見えるはず。 ６）塗り液が自然乾燥で見えなくなったら、送風30分以上で完全に乾燥させる。[リストA]へ戻る。
□9） 学習顕微鏡（明視野正立顕微鏡）
目的/理由. 染色標本の顕微鏡観察用。フィルムバッグを静置しそのまま細胞観察（検鏡）も可能。 ポイント. 光量は多め、シボリ調節で観察する。コンデンサーが付属する機種では、シボリは開放、光量はできるだけ多くし、コンデンサーの高さ調節で明瞭な観察像に努める。 補足. 無染色生細胞の観察には位相差装置付き倒立顕微鏡が適しているが、通常の学校顕微鏡で可能（薄層CG培養法を用いる：方法は別紙参照）。つまり、光軸傾斜法を行えば擬似微分干渉像として観察が可能でありライブ観察も可能となる。従って、本実験の発展展開として細胞分裂像の観察も可能である（学校具備の通常顕微鏡でも十分に可能：詳細は別紙参照）。 [リストA]へ戻る。
□10） 携帯（電話）カメラ （Fig22）
目的/理由. 現在の携帯電話のカメラ解像度はかなり優れているので顕微鏡観察像の撮影に用いる。 ポイント.手振れしないように支点・力点・作用点に配慮（工夫）する。 補足. 通常顕微鏡の接眼レンズの外径はφ30mmなので、携帯電話ケースのカメラレンズ穴に内径30mm弱のパイプつなぎ（YAZAKI:J-113）を接着するとカメラホルダーとして使用が可能（詳細は別紙参照）。 [リストA]へ戻る。
□11）35mm培養シャーレ、
＜材料解説：B. 試薬・溶液＞
B. 試薬・溶液の解説.
□1） フィルムバッグ細胞（FB細胞 無血清浮遊培養系の魚類FHLS細胞）
目的/理由. 細胞を健全に浮遊分散状態で輸送し、そのまま細胞実験に使えるとする培養技術はかなり限定的であるが、FHLS細胞をフィルムバッグ（ポリエチレン袋：非接着性・ガス透過性）に収容した場合は可能である（その詳細は特に複雑なのでここでは省略）。
ポイント.
(1) 細胞は無菌操作によりフィルムバッグ細胞（FB細胞）としている。不用意な開封はコンタミネーションを引き起こすため、その開封は実験実施日に行う。
(2) FB細胞を受け取り後は、室温で平置き静置状態で保管し、日に一度、水平振動を与え細胞を分散状態にする（細胞は自律的に徐々に凝集するので分散させる：重要）。
(3) 適温（管理温度）は20-30℃とするが、実験培養では迅速な細胞運動を期待するため、実験Aでは28℃程度が適している（20℃実験の場合、細胞運動速度はかなり遅くなる）。
(4) 提供するFB細胞は80万細胞/ml程度で調製されるが、受け取り後の保存・保管中も細胞は緩やかに増殖する。有効期限は細胞の送付に合わせて通知するが、１週間以上の有効期限の設定には特別な（いわゆる専門的な）操作や管理が必要となるので、初学者の場合は受け取り後、5日程度と考えて欲しい。詳細は文末のリクエスト時の確認事項を参照。
(5) 開封した細胞バッグは開口部を折り曲げし内液がシールに到達しない状態とする（シールに到達すると細胞液は自然に滲み出るので注意）。
(6)当たり前の話ではあるが、フィルムバッグ内には生きている細胞が入っているので不用意にバッグを押しつぶさないこと。
補足. 細胞液（培養液）は次の基礎培地にラクトアルブミン水分物を適量添加したもの。細胞はフィルムバッグ内では静置浮遊状態であり球状であるが、実験A,Bのように適切な培養基質（接着基質）に細胞が接すると細胞は自律的に接着し細胞運動を開始する。この基本的な性質に従い本細胞実験は成り立っている。 [リストB]へ戻る。水平静置で管理、凝集防止のため水平振動を毎日１回、室温保存、開封は実験当日、
□2） 液体培地/培養液（B-Med Waymouth’s MB 752/1 Ca-Free）
目的/理由. 本編の実験学習に用いる細胞FHLSの開発に用いた基礎培地であり静置接着培養にも適しているため。この培地は自家調製であり経費削減に大きく貢献している（成分委託調製培地は驚くほど高額）。ウェイマスさんが処方・開発した本培地は「既知の化学物質成分のみによる無血清無タンパク培地として開発されたはじめて培地」、成分は40種類くらい。ポイント.実験A,Bに使用する本培地は無血清・無タンパク状態である。 補足. pHはHEPES緩衝系、抗生物質はカナマイシンを使用。培地の保存は室温でも構わない。市販されているカルシウム不含培地を用いても本実験は成り立つはず。 [リストB]へ戻る。
□3） 固定液（G-Fix グルタルアルデヒド系） ・就学者対象では「酢酸エタノール系」
目的/理由. 細胞の微細構造も固定するため（固定能力が高いグルタルアルデヒドを主成分とする固定液）。 ポイント.スクロース添加調製による等張ホルマリン固定の場合でも細胞膜はブレッブを形成するが、本固定液では形成されない。固定液は危険液とみなしその取り扱いには十分注意する。就学者が用いる場合は指導者の適切な指導と配慮は重要（下記の染色液でも同様）。 補足. 通常、本固定液は使用濃度で提供されるが、必要量が多い場合は5倍濃度（濃縮液）で提供する場合もある。その場合は担当者が蒸留水（精製水）で等倍に希釈して使用する。室温保存。 なお、CG培養細胞の固定処理の時間は迅速を旨とするため2分としたが、処理時間を長く設定しても支障は生じない。
重要：学校などにおける就学者を対象とする実験学習の場合は安全操作や対策が必須であるため「非ホルマリン系：酢酸エタノール系」の固定液を提供する・用いる（手指などについても安全であるが、それでも固定液は安全操作は必須である）。 [リストB]へ戻る。
□4) 染色液（CV クリスタルバイオレット）
目的/理由. 汎用性が高く即効的に細胞染色が可能なため。使用濃度は0.25mg/ml（エタノール水混液）。 ポイント.上記の固定液と同様にその取り扱いには注意する。不用意なスポイト操作（ポンピングなど）により飛沫飛散が生じないように注意。万一手指に付着した場合は水洗・石鹸洗いで対応するが、残る場合はその脱色に70%EtOHを用いる。あるいは数日後には自然脱色するはず。 補足. 使用量が多い場合は、固定液と同様に、濃縮液（４倍濃度）で提供する場合もある。その場合は担当者が蒸留水（精製水）で等倍に希釈して使用する。室温保存。なお、固定液と同様に、CG培養細胞の染色処理の時間は3分としたが、処理時間を長く設定しても支障は生じない。 [リストB]へ戻る。
□5) ゼラチン液（Gel）：実験B用
目的/理由. 実験Bは主要な生体由来成分を用いた実験を旨としている。その一つがコラーゲン（構造性タンパク質としても最も含量が多い）。本実験ではその変性物質「ゼラチン：食用の板ゼラチン:大洋漁業」を用いている。1%の水溶液。 ポイント.低温・室温でもゲル状を示すのでStep1では加温溶解後の溶液状態で「MC/CGのゼラチン塗抹」に用いる。 補足.保存は室温でも構わない。 [リストB]へ戻る。
□6） メチルセルロース液（MC）：実験B用（必要に応じて）
目的/理由. 実験Bの対照実験が必要な場合に向けた試薬液。あるいはMC/CGを自作する場合に必要。0.025%水溶液で使用。 ポイント.MCは液性タンパク質で最大含量の血清アルブミンの代替品として使用しているが、その理由は、血清アルブミンと同様に細胞接着を阻害する効果があるため、また、試薬「血清アルブミン」は少し高価であり且つ腐敗しやすいため。 補足. 必要な場合はその旨を通知する。その場合、20倍濃度（濃縮液）で送るも可能なので蒸留水などで希釈し用いる。室温保存。 [リストB]へ戻る。
□7） Gel湯煎用のお湯：実験B用
目的/理由. 実験B工程１のゼラチン塗抹に用いるゼラチン液の加温溶解用。 ポイント.火傷しないでね。 補足. 寒冷期は、紙コップに30度程度のお湯を入れ、その上で培養実験を行うにも適している。 [リストB]へ戻る。
□8） 必要に応じて精製水（蒸留水DW）
□9） リン酸緩衝食塩水（PBS-：Caフリー）:必要に応じて
理由.培養中や固定前の細胞洗浄などに用いる。 ポイント.数十分程度なら培地の代替として使用することも可能。 補足. 12.5倍濃度の濃縮液で提供（使用時は4mlPBS-/46mlDWで希釈）。 [リストB]へ戻る。
□10） 70%エタノール水（70%EtOH）:必要に応じて
目的/理由. 本実験は無菌操作にとらわれず行うが、フィルムバッグを開封（熔着シールの切り取り）の時は、切り取り前にその部分や指先をエタノール消毒（70%EtOHを滴下した紙ナプキンで消毒）してから行うとコンタミネーションの確率がかなり下がるはず。 ポイント. 70%EtOHは可燃性であるので火の側で扱ってはいけない。容器には火気厳禁の表示が必要。 [リストB]へ戻る。
＜材料解説：C. 備品＞
C. 備品の解説.
□1） CGスライドガラスの静置用小型トレー（又は10cmシャーレ）
目的/理由. 受講者の実情（不測のことが生じる）への対策。CGスライドガラスのハンドリングが確実になるため。 ポイント. 紙ナプキンを敷いて使用する。固定染色操作の時も安全操作のため使用する。 [リストC]へ戻る。
□2） スコッチメンディングテープ あるいは、いわゆる「養生テープ：薄幅の緑」
目的/理由. スコッチテープ法という塗布物質の接着検査法があるが、スコッチテープはともかく使いやすい実験備品。水浸すると自然に剥がれやすくなる。鉛筆書きも可能。また、カバーガラスの「一枚釣り」にも適している。 ポイント.用いる時は剥がし易くするため角や短辺を折り重ねて「つまみ」を作り使用。 [リストC]へ戻る。
□3） ハサミ
目的/理由. 細胞のフィルムバッグ開口部は熱溶着によりシールされているのでその切り取りに使う。 ポイント.本実験では無菌操作に無頓着で行うが、予行練習などで数日連続して同一細胞バッグを使用する場合は、バッグ開口部やハサミを70%EtOHで消毒し切り取り開封するは必要であろう。なお、フィルムバッグのジップシールの開封の時は指をバッグ内に入れてはいけない。２本指でジップシールを挟みスライドさせ開口させる。 [リストC]へ戻る。
□4） 細書き油性ペン
目的/理由. 実験常備品。カバーガラスガラス面に書いても色が固着する品質の製品を用いる。 [リストC]へ戻る。
□5） 温度計
目的/理由. 培養温度の確認用。細胞は培養温度に依存して細胞運動が進行するため。実施時間が限られた実験学習の場合では温度確認と調節が重要である。 ポイント.トレーの上に置いて培養温度が測定できる小型品（観賞魚用？）などが適している（事前に温度補正も必要）。あるいは、放射熱温度測定機（赤外線温度計）がとても便利です。 [リストC]へ戻る。
□6) タイマー
目的/理由. 培養時間の確認。アラーム付きも必要。 [リストC]へ戻る。
□7) 紙コップ（小型・新品）、あるいは透明プラカップ
目的/理由. 飲料用の紙コップあるいはプラカップは多目的に使用する。本実験では、廃液入れ、切り取りスポイトのスタンド、溶液分注用、水洗用、寒冷期の保温管理などとして利用する。受講者多数の実験学習では「培養液の配布用カップ」や「フィルムバッグ細胞の一時収容容器」などとしても利用が可能である。 ポイント.下記８）のオモリを入れ転倒防止策として使用する。溶液の場合はその上に溶液用のカップを重ね入れして用いる。 補足.プラカップの場合は水洗し、再利用に努める。省エネ低コストは教材実験でも必要。 [リストC]へ戻る。
□8） オモリ（大型ワッシャー）
目的/理由. ディスポカップの転倒防止用。上記７）に記した経緯から。 ポイント.工具店などで扱う平板ワッシャーで大型を用いる。 [リストC]へ戻る。
□9） 紙ナプキン
目的/理由. 吸水性が高く、平面を提供し、紙タオルやキムワイプなどより有効で安価なため。CGガラスの静置や遠心後の上澄み除去などに効果的。 ポイント.省エネ：紙の使い過ぎや廃棄にも適している。 [リストC]へ戻る。
□10） 50mlビーカー
目的/理由. フィルムバッグの開封やその細胞のピペッティングの時に用いる。その後はスランドとして用いる。小型透明プラカップでも可。 [リストC]へ戻る。
□11）小型ピンセット
目的/理由. 固定・染色の水洗などで必要に応じて使用する。 [リストC]へ戻る。
□12） 遠心チューブ用スタンド
目的/理由. 微量遠心チューブの扱いに必要。なお、栄研3号スポイトのポンピング部を切断すればチューブスタンドに早変わり。または、厚み(1.5cmくらい)のある上質な発泡スチロールにコルクボーラーで穴開け作成する。薄いものは加温溶解用のフロートに用いる。 [リストC]へ戻る。
□13） 扇風機：実験B用
目的/理由. 工程1「MC/CGにゼラチン塗抹」の後は、10分程度自然乾燥させるが、その後は扇風機などで完全に乾燥させる、は実験Bの重要なポイント。 ポイント.自然乾燥させた後なら加温送風乾燥でも良い。ドライヤーやホットプレートの使用も可。ただし、細胞液を滴下する前には、室温に戻してから実験に使用する（暑い状態で細胞液を滴下すると塗抹ゼラチンが剥離する、細胞に熱ダメージが生じる）。 補足. 工程1を事前準備とする場合は、Gel塗抹後はそのまま室温保存で自然乾燥とする。
□14） ゴミ袋
目的/理由. 使い方は自由？：分別廃棄のため。 ポイント.小型ビーニール袋なら各実験テーブルにテープ止めして使用。 [リストC]へ戻る。
□15） 水道・水バット
理由.固定染色を行う場所とその水洗容器。 ポイント.３連の水紙コップの場合でも固定液や染色液が手に付いた場合のため水道設備は必要。 [リストC]へ戻る。
□16） 寒冷期は温度対策が必要。
目的/理由. 細胞は培養温度に依存し細胞運動を進める。実験Aを短時間で迅速に行うためには「28℃から33℃程度」の温度設定が必要である。ただし、35℃以上の設定は細胞にダメージが生じるので注意。実験Bの場合は25℃以上であれば十分である。
その加温保温として容易な方法は２枚重ねの紙コップに30-35℃のお湯を入れ、その上に薄いトレー（ディッシュ、あるいは平板）を敷き「培養台」として使用する。あるいは、 １）紙コップや小型の紙箱に使い捨てカイロを入れ用いる。ただし、温度管理に注意。 ２）または紙箱（靴の箱程度）にカイロを入れ「下敷き」を乗せ培養面とする。 ３）熱帯魚用の温度調節式パネルヒーターでも可、など工夫して行う。
ポイント. 35℃以上の設定は細胞にダメージが生じるので注意。 [リストC]へ戻る。
＜2b. 実験材料の写真と工程別の必要物品＞（数量算出表へ：3.1 Exp A、3.2 Exp B、材料解説へ）
＜3 細胞実験キットの構成品の数量算出法：様式１＞
3.1 実験キット構成品：数量算出表と方法（Exp A：CG-単純培養実験)・・リクエスト前の確認
- 下表が実験キット構成品の「内訳と数量算出法」です。実験Aと実験Bに区分して表記しています。この解説は実験Aに向けた説明ですが、実験Bの表記を理解するためにも必要です。
- 受講者多数の場合は、事前に協議・話し合いを行い、省エネ・低コスト化に向けた相互理解と対策が必要です。「迅速・簡便・確実・実効的」に加え「省エネ・低コスト化」は教材実験系の必須課題です。
- 下表の物品以外に新品の紙コップやテープなどの必需品が必要です。上図写真を確認。
- 細胞実験キットを学習の場で実施する場合は「４人１グープ/班」を念頭として準備します。下表の数量はその観点から理解します。実験方法や材料（Set 3 あるいは 図説集:DIY細胞実験）を理解した上で参照してください。不明・疑問は気軽にE-Mail羽曽部まで。
- 下表とその解説を「PDF印刷」で確認する場合は「ココ」をクリック。
- 実験学習の受講者が多い場合（数十人以上の場合）は、輸送仕様は個別パックでなく一括して送る場合があります。受け取り後は受講者へは配布しやすい方法に工夫してください。
- 「B.最低数量」の算出の理由と経緯は「表下の解説」を参照。
工程：(1)CGの準備→(2)細胞調製（遠心再浮遊）→(3)培地・細胞液の滴下と培養→(4)固定染色
＜3.1 主材料の数量算出表と方法（Exp A：CG単純培養実験)：解説は表下です＞
＊ ４人構成で＿＿班、総人数＿＿人（学習者＿人+ 担当者＿人）。
＊ 班数は総人数の繰上げで算出。D 総数量 = C x班数。 材料の写真は「ココ」A. 物品（工程） 略号 B. 最低必要数量 C.数量/班 D.総数量 E.輸送仕様 1 カバーガラス (1) CG 1枚（２培養/CG） /人 5枚 ＿＿枚 5枚/pc. 2 遠心チューブ (2) CT 2ml容量tube １個/班 1個 ＿＿個 4本/pc. 3 細胞(液) (2) Cell 1.5ml/遠心tube 1.5 ml ＿＿ml 12ml/pc. 4 培地/Step 2 (2) B-Med 1.5ml/再浮遊 3.0 ml ＿＿ml バルク/pc. 5 培地/Step 3 (3) B-Med 2滴/培養x 2培養 = 0.2ml 6 固定液 (4) Fix 3滴/培養x 2培養 = 0.3ml
（0.3ml/2培養/CG）2.0 ml ＿＿ml バルク/tube 7 染色液 (4) CV 2.0 ml ＿＿ml バルク/tube 8 栄研スポイト3号 SP 5本/班 5本 ＿＿本 10本/pc 9 5本/実施担当者/全体 5 本 上記は「細胞実験キット」の基本仕様。Cは予備も含めた数量。Eは一括（バルク）の場合もあります。実験には上記以外の物品「例えばスライドガラスや遠心機、紙ナプキンなど」を必要とします（利用者側で準備します）。それらをリクエストする場合は、その説明と必要数量を上記書式に従い連絡・協議が必要です。注意：細胞や培地(B-Med)は無菌仕様で送付されます。その開封や分注は実施日に行ってください。 なお、スポイトの「１滴は約0.05ml」とみなします。
＜上表の解説：数量算出の基準＞
＊ 下記が意味不明な場合は実験マニュアルや実験材料を参照の上で改めて理解に努めてください。
- 1. カバーガラス(CG)「工程(1)」： CGは一人1枚２培養（２つの液止めサークルを描く）で使用します。CG１枚で２培養が可能なので、左右のサークル（培養面）を「培養時間の差異：例えば、5分培養と30分培養」など任意の目的に使用します。CGは４人班あたり予備１枚を与え、班当たりの必要数量は５枚です。
- 2. 遠心チューブ（2ml容量tube）「工程(2)」： 班当たりの必要数は１個。総数には予備数個を含めます。
- 3. 細胞液「工程(2)」： フィルムバッグ細胞（FB細胞）は、４人分/班あたりの必要量は1.5ml/遠心チューブで十分です。遠心処理（6500rpm 10秒）の後、等量(1.5ml)の液体培地（B-Med）を加え再浮遊します。
- 4・5. 液体培地（B-Med）「工程(2)と(3)」： その用途は遠心後の再浮遊と培養開始時に用いる滴下培地です。１サークルにB-Med２滴（約0.1ml）を滴下し、Step2で調製した細胞液（CR細胞）を1滴（約0.05ml）加え培養を開始します。従って、班あたりのB-Medの必要量は、遠心分離後の再浮遊用に1.5ml。サークル滴下用は２滴0.1ml/1サークルの２培養（２サークル）なので４人分は0.8mlなので、培地の最低必要量は2.3mlですが、予備CGも含め10培養なので、従って、B-Medの配布量は余裕を与え3ml/班とします。配布分取する時はそれ以上の多めが適しています。
- 6・７. 固定液・染色液「工程(4)」： 固定液（Fix）は１サークルあたり3滴（約0.15ml）、染色液（CV）も３滴で実施します。従って、その必要量は２培養と予備も含め10培養なので班当たりの必要量は1.5mlですが、配布量は余裕も与えそれぞれ2.0ml。なお、固定液は安全対策から非ホルマリン系を使用します。
- 8・9 栄研スポイト３号：この名称は商品名（他に変えがたい品質であり識別のためこの名称を使用しています）。栄研３号スポイトは目的用途に対応させ、識別・使い分けで使用します。使い回し・混用はダメ（混同使用は細胞培養と細胞運動に強い影響を与えます）。また、本スポイトは通常の「液の出し入れ」などの用途の他に、代用試験管としても使用します。つまり、スポイトのメモリ2.0レベルをハサミで切断し、その切り取りスポイトを小試験/代用試験管（溶液の分注・配布用）としても用います。４人班当たりの必要数はそれで予備も含め５本です。つまり、その用途は、１）細胞液の採取分注用、２）液体培地の分取・添加・滴下用、３）細胞の再浮遊用、と４）液体培地を分取する「切り取りスポイト」用です。その他に固定液用、染色液用も必要ですが、固定液と染色液に用いるスポイトは「使用済みスポイトを水洗・水切り」して再利用します。以上が受講者４人用の必要数です。
それ以外に、実施責任者が担当・用意・必要とするスポイトが予備も含め5本としています。つまり、Step 2のフィルムバッグ細胞の前処理用や液体培地（B-Med）の分注用などに用います。 - 補足１：固定液・染色液は低コスト化のため、学校具備のガラス製の小試験管を使用してください。切り取りバイアルは50mlビーカーや転倒防止用オモリを入れた透明プラカップ(小)に立て利用します。
- 補足２：微量遠心機ではなく通常の15mlバケットの遠心機の場合は、スポイトの切り取りの長さを調節し、その切り取りスポイトを遠心チューブとして使用することも可能。ただし、遠心速度は2000rpm以下で使用する。
- 補足３：遠心再浮遊した細胞液（CR細胞）1.5mlは30回分の実験A(CG１枚で２培養なので15人分)に相当します。また、フィルムバッグ細胞は通常12ml包装なので約120人分（２サークル培養で120回分）の実験A（CG単純培養）に相当します。
- 実験Aの残り（FB細胞）は次の実験B（OEKAKI）に用います。
- 実験AのPDF印刷用
3.2 実験キット構成品：数量算出表と方法（Exp B：CG-OEKAKI実験)・・リクエスト前の確認
- 下表の考え方は上記の「3.1：CG単純培養実験」と同じです。前ページ「実験A」の解説を理解した上で、下記「実験B」の理解を進めてください。
- ただし、受講者多数の場合は、事前に協議話し合いや省エネ・低コスト化対策は重要です。相互理解と対策が必要です。例えば、遠心分離を行わず長時間の静置培養（放置培養）での対応も可能です。
- 実験A/B一緒のPDF印刷用
工程：(1)CGの準備→(2)細胞調製（遠心再浮遊）→(3)培地・細胞液の滴下と培養→(4)固定染色
＜主材料の数量算出表と方法（Exp B：CG-OEKAKI実験)：解説は表下です＞
＊ ４人構成で＿＿班、総人数＿＿人（学習者＿人+ 担当者＿人）。
＊ 班数は総人数の繰上げで算出。D 総数量 = C x班数 材料の写真は「ココ」A. 物品 （工程） 略号 B. 最低必要数量 C.数量/班 D.総数量 E.輸送仕様 1 MCカバーガラス (1) MC/CG 1枚 /人 5枚 ＿_枚 5枚/pc 2 ゼラチン液 (1) Gel ごく少量 0.5ml ＿_tube 0.5ml/tube 3 クラフト綿棒 (1) CS 1本/人（竹串でも可能） 5本 ＿_本 ５本/pc. 4 遠心チューブ (2) CT 2ml容量tube 2個/班 2個 ＿_個 4本/pc. 5 細胞(液) (2) Cell 2.0ml/遠心tube x 2 4.0 ml ＿_ml 12ml/pc. 6 培地/Step 2 (2) B-Med 1.0ml/再浮遊 x 2tube 2.5 ml ＿_ml バルク/pc. 7 固定液 (4) Fix 3滴/培養 ： 0.15ml 1.0 ml ＿_ml バルク/tube 8 染色液 (4) CV 1.0 ml ＿_ml バルク/tube 9 栄研スポイト3号
（実験Aの再利用）SP 5本/班 5本 ＿_本 10本/pc 10 5本/担当者/全体 5 本 表解説は前述の「実験A」と同じ。上記は「細胞実験キット」の基本仕様であり、利用者との協議に基づき改変し提供予定。利用者準備のスライドガラスなどは「材料一覧」で確認が必要である。補足. MCカバーガラス （メチルセルロース処理済みのカバーガラス：MC/CGと略記）。注意：実験A/Bを前後あるいは同時に行なう場合、「8,9のスポイト」は実験Aで用いたスポイトをその用途別に再使用してください。スポイトの「１滴は約0.05ml」とみなします。
＜上表の解説：数量算出の基準＞
（前ページ「実験A」の解説を理解した上で、下記「実験B」の理解を進めてください。）
- 1. カバーガラス(MC/CG)「工程 (1)」： 実験Bではメチルセルロース処理済みカバーガラス（MC/CG）を用います。描く「液止めリング」（培養面）は１つです。予備も含め班あたりのMC/CGは5枚を配布します。
- 2・3. ゼラチン液(Gel)と綿棒「工程 (1)」： MC/CGに塗抹（塗り付け）するGelの必要量は、綿棒先端に少量なので、班あたりの配布量は0.5mlで十分です。綿棒も班５本で配布します。ただし、両端が綿棒である場合はその半数です。ハサミで半分に切り取り使用します。なお、食用「竹串」でも代用が可能です（材料を参照）。
- 4. 遠心チューブ（2ml容量tube）「工程 (2)」： 班当たりの必要数は2個。総数は予備数個を含めます。
- 5・6. 細胞液と液体培地（B-Med）「工程 (2)」（２倍濃縮細胞液の作り方と必要量）：
実験Bでは１サークルに６滴（約0.3ml）を滴下し細胞培養を行います。４人班なので最低1.2mlの細胞液が必要ですが、実験Bでは２倍濃縮の細胞液を必要とするため、下記の方法で遠心再浮遊しその細胞濃縮液を調製します。
＊班あたり２本の遠心チューブに、フィルムバッグ細胞（FB細胞）をそれぞれ2ml分注し、遠心分離（6500rpm 10秒）。上澄みを除き、タッピング処理を加えた後、それぞれに1mlのB-Medを加え再浮遊させ２倍濃度の細胞液とします。
（高濃度の細胞液の調製が必要なため「２mlの細胞液」に対し「1mlのB-Medで再浮遊」し細胞濃縮液を調製します）。
２本の遠心チューブを用いたので合計2mlの濃縮細胞液が調製されます。なお、実験Bで滴下する細胞液の量は6滴（0.3ml）/サークルです。従って2mlの濃縮細胞液は6人分、6回のお絵描き実験に相当します。
従って、班あたりの配布数量は、細胞液（FB細胞）が４ml、再浮遊用のB-Medは余裕を与え2.5mlです。
＊補足：CG-OEKAKI実験を数十人以上で行う場合は種々の変法を提案する場合があります。 - 7・8. 固定液（Fix）・染色液（CV）「工程 (4)」： 固定液・染色液ともに必要量は3滴（約0.15ml）です。４人班あたりの配布量は、余裕や扱いやすさを考慮し、Fix・CVとも1mlで十分なはずです。固定液は、学校で利用する場合、安全対策から非ホルマリン系で送る場合もありますが、必要量などは同じです。なお、これらの溶液は学校具備の小試験管などに分注し配布し、使用済みのスポイトを水洗いして再利用で用います。
- 9. 栄研３号スポイト(操作・溶液分注用)： 実験Bは実験Aを行った後あるいは直後に実施とするため、であるため、操作・分注用のスポイトは実験Aで使用したものを再利用してください。実験Aと別の日に実施の場合は、使用済みスポイトや切り取りスポイト（試験管）を、水道水で内容物を十分に洗い流し、精製水で濯ぎ、水切り、再利用してください。
- 実験A/B一緒の実験簡易マニュアル（PDF印刷用）
4. 細胞実験キットのリクエストと実施様式：確認事項や請求方法
＜4.1 細胞管理と有効期限について＞
＜4.2 最初の一歩の「リクエスト前の状況確認」：様式１＞
＜4.3 実施計画の立案・協議のために：様式２＞
〔4.3-A. 実施計画表〕 〔4.3-B. その他の状況〕 〔4.3-C. その他の物品のリクエスト〕
〔4.3-D. 自由記述：質問や感想・提案〕
＜4.4 実施終了後の情報提供のために：様式３＞
〔4.4-A. 実施記録表〕 〔4.4-B. レポートの様式：実験終了後に〕
＜5. 実験キット提供の付帯条件（略記）＞
はじめに： 皆さんが「試してみたい・実施しよう」と予定・計画する細胞実験は、Webサイトで紹介した通り、生きている魚類培養細胞を用います。初学者にはイメージしにくいことですが、そもそも生きている動物培養細胞をReady-To-Useの状態で輸送し、専門技術を必要とせず細胞実験に用いることはほぼ不可能ですが、本システムはそれが可能です。それで簡単共有・教材実験系として検証中です。
しかし、やはり、それでも、幾つかの重要なポイントがあります。そのひとつが下記の「4.1.細胞管理と有効期限」です。これはとても重要なので、細胞（フィルムバッグ細胞）が到着する前にその意味のご理解をお願いします。また、細胞実験を予定調和的に進めるには日程や計画も大切です。そのために下記「目次」のような項目について確認しながら首尾よく実験が進むように計画してほしいと思っています。それで「DIY細胞実験」です。
下記を参照後、もし、試してみたい場合は電子メールで気軽にご連絡ください。とりあえず話し合いをしましょう。同時に、この文書と類似の書式を電子メールで送付します。その目的は学習教材としての本実験系が「最小努力・最大効果」となるためです。簡単共有による実証試験を期待しています。ご協力をお願い申し上げます。
＜4.1. 細胞管理と有効期限について＞
-
宅配輸送した場合、フィルムバッグ内の細胞は、輸送中の振動のため、バッグの角などの一部に寄り集まり、可視的な大きな凝集塊になります。この状態は細胞にとって最悪な過密凝集状態なので、受け取り後は速やかに水平振動を与え、細胞を分散させ、下記に従ってください。それで、到着予定日は受け取り待機が不可欠です。
-
フィルムバッグ細胞の有効期限は、受け取り後、室温管理下で「５日間」です。受取日（0日目）のフィルムバッグ細胞は休養が必要なので実験には使用できません。細胞バッグは「平置き・静置・室温」で保存・管理しますが、可能なら日に一度、水平振動を与え、細胞凝集を分散状態にしてください。 室温とは「人にとって快適な温度域：20℃以上」と考えてください。寒冷期は少し注意してください。但し、本細胞は低温には耐えますが、実験前には丸一日間の室温保存が必要です。
-
細胞バッグを開封するとその翌日にはコンタミネーション（雑菌増殖）が生じる危険性があるので、細胞バッグの開封は実験実施日に行います（所定実験に使用してください）。
-
細胞は日々緩やかに増殖しています。その結果、有効期限の後半（4,5日目）にはその濃度が1.5倍程度になる予定です。その後は培地成分の劣化により細胞活性が低下します。このため有効期限を設定しています。
-
なお、擬似無菌操作により丁寧な操作を行えば、数回に分けて同一フィルムバッグの細胞液を使用することもできます。また、有効期限の延長が可能な仕様での提供も可能ですが、その場合は、研究グループの経験者などのアドバイスを必要とします。初学者の場合は期限厳守で使用してください。
＜先頭行へ移動・目次へ、４の目次へ＞
＜4.2 最初の一歩の「リクエスト前の状況確認」：様式１＞
- 細胞実験キットを「試してみたい・実験学習に用いてみたい」などの経緯から連絡を受けた場合、最初にこの文書「4.2」を電子メールで送付します。下記は「様式１.リクエスト前の状況確認」です。必要事項を記入し、質問や提案なども含め、電子メールで返送してください。但し、マクロ機能などへの変換などは行わないでください。
- 初学者には意味不明も多々あると思います。世の常ですが「無理なく・気軽に・段階的・実効的に」は重要です。それで、下記の記述記入の途中であっても気になることは気軽にご質問ください。投げやりになることなく相互理解に基づき一歩一歩進めましょう。
- なお、実験キットの提供は教材学習に向けた実証試験の観点から提供されるので「関連する付帯事項」があることもご理解ください。 ご協力をお願いします。
- 稀にあることなのですが「読まない・考えない・準備しない」という状況が生じないようにお願いします。
＜下記は「様式１：状況確認」の質問や確認事項です＞
- 本書式（送付は 月 日）を提出する日付（返信日）：
- 実施担当者（請求者と同じ：責任者）の氏名（ふりがな）：
- 担当者（2と同じ：実際に細胞を扱う方）の所属・職種・輸送先住所・電話番号：
- 細胞実験キット「研究グープ」の紹介者、あるいは、協力者はいますか（いる場合は氏名と所属）：
- 本件の細胞実験キットを実際に見た・扱ったことはありますか。あるいは、知った経緯など、その状況をお知らせください：
- はじめて希望する・請求したい方は教科教育の観点からその経緯や目的を具体的に数行程度でお知らせください：
- 実験マニュアル〔Webマニュアル：Set３、あるいは、図説解説CG細胞実験〕を参照し、実技操作の上で戸惑いを感じる工程や操作はありましたか。ある場合は具体的にお知らせください：
- 細胞実験を行う時、実際に参照し実技操作に用いる「実験マニュアル：PDF」はどのサイトのどの部位にあるものを使用する予定ですか。少し戸惑いの質問なのですがお願いします：
- 実験マニュアルなどを参照後に改変や修正したいことはありましたか：
- Web資料を参照後、任意の実験を首尾よく迅速簡便に実施できると思いましたか・難しいと思いますか？：
- 実施準備：「Webマニュアル：Set５：材料概要と必要数量、物品算出法（表3-1, 3-2）」に基づき提供する実験キットの物品（構成品と数量）が決まるので、通読・確認し、意味不明瞭な箇所がある場合はお知らせください：
- なお、実験キットの提供（輸送）は相互理解が確定後10日後（以降）になりますが大丈夫ですか。希望などあれば遠慮なくご連絡ください。
以上：リクエスト前の状況や対応状況についてお知らせください。意味不明な事項はそのまま率直なご意見をお願いします。
本項（下記）は電子メール本文として送ることもあります。その場合はそのまま記入後、返信回答でOKです。
下表の記入項目「A-H」は、表の下の「解説」を参照の上で、記入・回答して下さい。選択肢が該当しない場合は適切な率直な回答をお願いします。
提供する物品（実験キット）は下表「E.班数」に基づき準備しますが、その数量は「表3-1,3-2」から算出されるので記入前に確認してください。なお、本表提出後に協議が必要な場合もあります。また、この段階で戸惑いや協議が必要な場合は具体的にその概要をお知らせください。協議しましょう。
| 〔4.3-A. 実施計画表〕 （ほぼ確定の事項を記入。セル幅を広げるや複数行で記入してもかまいません） |
||||||
| # | A.実施日/曜日 |
B.実施時間 |
C.実験名 |
D.人数 |
E.班数 |
F.バッグ数 |
| １ | ||||||
| G.目的： | ||||||
| H.その他： | ||||||
| 2 | ||||||
| G. | ||||||
| H. | ||||||
| 3 | ||||||
| G. | ||||||
| H. | ||||||
#. 実施番号（順番）
： 実施時間(B)や人数(D)を考慮し「無理のない実験計画」が実施単位なので、
複数回を計画の場合はそれぞれについて記入します。
4回以上を予定の場合は追加記入してくだい。
A. 実施日/曜日：実施予定日：細胞バッグを実験のため開封する日。
B. 実施時間：工程2以降の開始終了時間、学校時間割表の区分など。
C. 実施する実験名
：選択A.CG単純培養実験, B.CGお絵描き実験,あるいは、C.両実験。
D. 人数：参加者数。・・・４人構成で＿＿班、総人数＿＿人（学習者＿人+ 担当者＿人）
E. 班数：この班数に基づき、表3-1, 3-2から提供物品が算出されます。
F. バッグ数：12ml細胞バッグの請求数。
G. 目的（選択）：予行練習、授業実験、教員研修会、生徒さんの部活、などを記入。
H. その他：実施概要や計画に関わる補足のために利用してください。
また、実験Bの工程4（固定染色）をB（実施時間）とは別時間に行う場合はその概要を記入してください。
〔4.3-B. その他の状況〕
〔4.3-C. その他の物品のリクエスト〕
3のリクエスト算出表（提供品）に提示した物品以外で提供が必要な物品（材料一覧を参照）がある場合は下表に記入してください。あるいは、提供品が既にある場合は「不必要」の材料名を記入してください。特に「栄研３号スポイト」は本編解説のように実験学習の場にとても有効な器具です。学校常備の備品と考えても良いと思っています。なお、遠心機の場合は「貸し出し」です。
| 表4.3-C. 追加また不必要する実験材料 | |
| # | 算出表の物品の他に必要する材料と数量、簡略なその説明を記入する。 |
| １ | 追加： |
| 不要： | |
| ２ | 追加： |
| 不要： | |
〔4.3-D. 自由記述：質問や感想〕
上記以外で質問や感想などあれば自由に記述・提案してください：
＜4.4 細胞実験キットの記録書式：提出様式３＞
細胞実験キットを受け取った時点から下表の様式に準じて、フィルムバッグ細胞の様子や扱いを簡略に気楽に記録してください。細胞実験に関して気になること、特に戸惑ったことや困ったこと、なども実証実験の観点から大切です。。その都度メモや略記してください。なお、終了後はご提供をお願いします。些細なご意見でも他の方の力強い支援となるはずです。お願いします。
| 〔4.4-A. 実施記録表：書式〕 実施目的： |
||||||
| 日付 | A.温度 | B.ID | C.イベント | D.状況・コメント | E.コンタミ | |
| 0日目 | 受け取りとその通知 | |||||
| 1日目 | ||||||
| 2日目 | ||||||
| 3日目 | ||||||
| 4日目 | ||||||
| 5日目 | ||||||
| 6日目 | ||||||
| 日目 | 細胞の破棄処分報告 | |||||
| 日目 | レポート提出 | |||||
|
||||||
| お願い：物品送付の折は到着日や取り扱い番号を事前通知しますが、学校内で到着後に行方不明が起こらないように配慮して下さい（受け取りの通知をお願いします）。 | ||||||
〔4.4-B. レポートの様式：実験終了後に担当者自身の経験から記述〕
次の４項目について、電子メールでお知らせください。上表との関連などから記述していただければ助かります。なお、当方にとって最も有用なご意見や情報は「戸惑ったこと・困ったこと」です。苦情などでもかまいません。
なお、気づいた時にその都度メール送信で提供していただくこともとてもウェルカムです。どうかよろしくお 願いします。
- 実施後の感想と意見。
- 予想外の事項があった・気づいた場合は、実験区分と工程に応じ（箇条書き）、その状況と感想・意見。苦情なども。
- 標本観察と「生物学演習のSet 2. 観察の指針」について、実践の観点から意見と感想。
- 標本の結果「顕微鏡写真：中程度の画像サイズ」の提供。
- （受講者レポートの添付も可）
5. 細胞実験キット提供の付帯事項
1. 安全確認による実施、
2. 実施状況（実施記録・意見・結果写真）の提供、
3. 細胞の再分与禁止、
が付帯条件です。
4. とても重要なこととして付記したいことは「無理なく・気軽に・段階的・実効的に」です。
「連絡協議は相互に誠実に」でお願いしています。面識のない方との話し合いには不可欠です。 （必要に応じて「ライン」による無料電話もウェルカムです）。
5. 補足. 細胞実験キットは実践学習教材を目的に提供されます。その他の利用は禁止です。＜補足＞
生物学習・生命科学の理念は 「実体と概念の連立連携 ・ 木を見て森を見ずの回避」 にある。その「論より証拠・されどロジックも」には「介在性構造レベル」の具現化・構造化・Showing を必要とする。しかし「器官系・組織」に加え「細胞機能の系統や巨大分子」の扱いは一筋縄には進まない。それ以前にそれらの起点となる細胞レベルにリアリティーが求められている。誰もが認める周知の事実。簡単共有が可能な細胞実験系への期待である。それで細胞実験学習は必要不可欠である。モヤモヤ・スッキリ変換の道筋の起点であり、考える学習への原点を提供すると考える。（「図説集：CG細胞実験」のシート３から 抜粋）
以上で「セット５は終了」です。
＜28-30＞
（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.28 中 Fig.29 右 Fig.30 )
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＜31-33＞
＊
（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.31 中 Fig.32 右 Fig.33 )
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＜34-36＞
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.34 中 Fig.35 右 Fig.36 )
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＜37-39＞
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.37 中 Fig.38 右 Fig.39 )
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＜40-42＞
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.40 中 Fig.41 右 Fig.42 )
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＜43-45＞
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.43 中 Fig.44 右 Fig.45 )
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＜46-48＞
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.46 中 Fig.47 右 Fig.48)
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＜49-51＞
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.49 中 Fig.50 右 Fig.51)
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＜52-54＞
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.52 中 Fig.53 右 Fig.54)
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＜55-57＞
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.55 中 Fig.56 右 Fig.57)
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＜58-60＞
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（画像クリックで拡大表示： 左 Fig.58 中 Fig.59 右 Fig.60)
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＜＊＊＊＞
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